視黃醇結(jié)合蛋白4 (RBP4)膠體金快速測(cè)試試紙條
背景簡(jiǎn)介
視黃醇結(jié)合蛋白( retinol-binding protein ,RBP) 為血中維生素A（VitA）的特異轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。目前已發(fā)現(xiàn)七種不同的RBP亞型，主要分布于血液循環(huán)系統(tǒng)（RBP4，簡(jiǎn)稱(chēng)RBP）、細(xì)胞（RBP1，RBP2，RBP5，RBP6，RBP7，簡(jiǎn)稱(chēng)RBPs）和視網(wǎng)膜光感受器間（RBP3，簡(jiǎn)稱(chēng)IRBP）。RBP4(Retinol-binding protein 4；RBP4；NM_006744) 為一種單一肽鏈蛋白質(zhì)。
腎小管疾病導(dǎo)致腎小管蛋白重吸收功能下降時(shí)，尿液中RBP4含量就會(huì)上升,在病情進(jìn)行的初期約1-3mg/24h，嚴(yán)重時(shí)高于3mg/24h以上。（以正常人每天排尿量1.5升計(jì)算，約為0.67-2ug/ml,為正常人的10倍以上）,故尿液中RBP4增高具有早期診斷意義,是一種評(píng)價(jià)腎臟疾病特別是腎小管損傷疾病的良好指標(biāo)。此外，肝膽系統(tǒng)疾病，如病毒性肝炎早期等、甲狀旁腺功能亢進(jìn)、營(yíng)養(yǎng)不良均可引起血中RBP4降低，而慢性腎臟疾病時(shí)則升高。
本公司提供一種檢測(cè)視黃醇結(jié)合蛋白的免疫膠體金試紙條，該試紙條操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，全過(guò)程只需10分鐘，不受環(huán)境條件的干擾，特異性好，且檢測(cè)靈敏度高，最低檢測(cè)限為1ng/ml。本發(fā)明使用于醫(yī)院常規(guī)檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)尿樣中視黃醇結(jié)合蛋白4的快速檢測(cè)。
具體實(shí)驗(yàn)方法：
1.天然RBP4蛋白提取工藝的確定
視黃醇結(jié)合蛋白在腎小管損傷疾病病人的尿液中含量較之正常人尿樣中含量高出10倍以上。故從腎小管損傷疾病病人的尿液中可以提取天然視黃醇結(jié)合蛋白。純化采用親和層析的方法，使用的是GE Healthcare AKTA 純化系統(tǒng)，采用的純化柱也是購(gòu)自GE公司。講病人的尿液進(jìn)行預(yù)處理后，通過(guò)具體的純化工藝包括離子交換柱、疏水層析、分子篩方法得到了天然的RBP4蛋白(圖1)
如圖1：泳道1是蛋白Marker；泳道2-5是第一批腎小管損傷病人尿液樣品經(jīng)過(guò)離子交換層析、疏水層析和分子篩后分管收集的蛋白樣品；泳道6-9是第二批腎小管損傷病人尿液樣品經(jīng)過(guò)離子交換層析、疏水層析和分子篩后分管收集的蛋白樣品。
2.RBP4單克隆抗體的制備
最終篩選得到3株雜交瘤細(xì)胞株，效價(jià)見(jiàn)表 1：
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Ab titer (OD450±SD)* |
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S-17-4 |
IgG1,κ |
1.090±0.002 |
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SA-64-11 |
IgG2a ,κ |
1.159±0.041 |
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S-113-7 |
IgG2a ,κ |
1.520±0.033 |
表1 3株雜交瘤細(xì)胞株的抗體效價(jià)及亞型鑒定
*此效價(jià)是指在培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞時(shí)上清中的抗體的效價(jià)
3. RBP4單克隆抗體的鑒定和分析
?。?）尿液中RBP4蛋白的免疫印跡檢測(cè)
樣品：陽(yáng)性對(duì)照純化好的天然視黃醇蛋白；腎小管疾病病人尿液P1，P2，P3（來(lái)源于上海第六人民醫(yī)院腎臟科）；正常人尿液N1，N2，N3；陰性對(duì)照是BSA。樣品上樣量：5μl。 
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2（克隆號(hào)S-113-7單克隆抗體實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖）和圖3（克隆號(hào)SA-64-11單克隆抗體實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖）。結(jié)果表明，所制備的抗RBP4鼠單克隆抗體能夠有效的識(shí)別腎小管疾病病人尿液中的RBP4，而對(duì)正常人尿液中的痕量RBP4沒(méi)有反應(yīng)（免疫印跡法一般僅能檢測(cè)1ng以上的目的蛋白，而試驗(yàn)時(shí)每個(gè)泳道本發(fā)明人僅加了5μl尿液，按照正常人尿液的RBP4水平，其中所含的RBP4不足1ng）。
?。?）抗體配對(duì)以及ELISA試劑盒構(gòu)建
從圖中我們可以看到，這兩株單克隆抗體識(shí)別RBP4的不同位點(diǎn)，可以很好的配對(duì)，雙抗體（S-113-7和SA-64-11）夾心ELISA：靈敏度：1ng/ml，線性范圍：1-10ng/ml，可以用于制備RBP4檢測(cè)試劑盒。
（3）膠體金快速檢測(cè)試紙條的小樣本臨床試驗(yàn)
來(lái)自上海市第一人民醫(yī)院的腎臟損傷和腎移植病例40例尿樣開(kāi)展小樣本臨床試驗(yàn)。首先對(duì)40例樣本進(jìn)行ELISA檢測(cè)（上海德波），確定其中所含RBP4蛋白的含量。
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試紙條檢測(cè)結(jié)果： |
商業(yè)RBP ELISA試劑盒結(jié)果： 
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弱陽(yáng)性（100ng/ml<RBP4<1000ng/ml） |
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強(qiáng)陽(yáng)性（RBP4>1000ng/ml） |
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 RBP4金標(biāo)快速檢測(cè)試紙條產(chǎn)品形態(tài)： 通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)所有100ng/ml以下的尿樣在膠體金免疫層析試紙上均為陰性結(jié)果；所有100ng/ml以上的尿樣在膠體金免疫層析試紙上均為陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)，1000ng/ml以上的尿樣以及15號(hào)尿樣（944ng/ml）均為強(qiáng)陽(yáng)性結(jié)果，其他為弱陽(yáng)性結(jié)果。因此，以100ng為陽(yáng)性判定結(jié)果，我們的膠體金免疫層析試紙與商業(yè)ELISA試劑盒的符合率為100%。 |
取得成果
制備了針對(duì)RBP4蛋白的高親和力單克隆抗體，并運(yùn)用該單克隆抗體配對(duì)組裝成ELISA檢測(cè)試劑盒和膠體金快速檢測(cè)試紙條。
ELISA試劑盒靈敏度達(dá)到1ng/ml，線形檢測(cè)范圍為1-10ng/ml。
膠體金試紙條檢測(cè)限為100ng/ml。進(jìn)行了小樣本臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)表明，所有RBP4含量在100ng/ml以下的尿樣在膠體金免疫層析試紙上均為陰性結(jié)果；所有100ng/ml以上的尿樣在膠體金免疫層析試紙上均為陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)，1000ng/ml以上或接近的尿樣均為強(qiáng)陽(yáng)性結(jié)果，所研發(fā)的膠體金免疫層析試紙與商業(yè)ELISA試劑盒的符合率為100%。
申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利3項(xiàng)：
視黃醇結(jié)合蛋白單抗、其雜交瘤細(xì)胞及其制備方法和用途（200910055428.5）
RBP4單抗、其雜交瘤細(xì)胞及其制備方法和用途（200910055429.X）
RBP4雜交瘤細(xì)胞株及其制備方法和用途（200910055427.0）
Reference:
evelopment of retinol-binding protein 4 immunocolloidal gold fast test strip using high-sensitivity monoclonal antibodies generated by DNA immunization. Acta Biochim Biophys Sin(2010)42(12):847-53
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